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WP 1.1 - Chromosome engineering and living cell array

Leader : Pr Anthony Wilkinson

Workpackage leader: University of York, Pr. Anthony Wilkinson

WP1.1 produira du matériel biologique et une « chromosome engineering toolbox »:
Des biopuces à l’échelle du génome dans lesquels chaque région intergénique comprenant des promoteurs, contrôle l’expression d’une protéine rapporteur fluorescente, dans le but d’observer l’activité des promoteurs en temps réel dans les cellules vivantes
Une « toolbox » moléculaire permettant un marquage et une production de protéines efficace chez B. subtilis et chez les bactéries Gram-positive pathogènes phylogénétiquement proches
Une collection de souches dans lesquelles les facteurs de transcription (TF) sont marqués par une étiquette (« épitope-tag »).
Dans le cadre de WP 1.1, une innovation majeure de BaSysBio sera la construction d’une « cell array » à une échelle sans précédent. La « cell array » sera composée d’environ 1500 souches dans lesquelles les régions intergéniques contenant des promoteurs contrôleront l’expression d’une protéine rapporteur fluorescente. La mesure de l’accumulation fluorescente dans une population de cellules (Ronen et al. , 2002; Zaslaver et al. , 2004) ou dans des cellules individuelles (Friedman et al. , 2005; Rosenfeld et al. , 2005) permet de déterminer l’activité des promoteurs en temps réel . L’activité des promoteurs dirige la synthèse de l’ARN et l’accumulation d’ARN, mesurée en utilisant des micro-puces à ADN, reflète l’équilibre entre la synthèse et la dégradation de l’ARN. Ainsi, la combinaison des micro-puces à ADN et des « living cell arrays » facilitera l’identification de nouveaux mécanismes de régulation au niveau des systèmes. Tout en complétant le travail des micro-puces à ADN, la « cell array » présente d’autres avantages. Plus important encore, les « cell arrays » peuvent être utilisées pour observer/mesurer l’activité des promoteurs dans une cellule individuelle, permettant de visualiser les fluctuations dynamiques au sein des cellules individuelles et ainsi révéler l’hétérogénéité des populations de cellules. Cette information peut être intégrée avec les données protéomiques (par exemple : quantité de facteurs de transcription) afin d’élucider les circuits de régulation (Rosenfeld et al., 2005). Du fait que les « cell arrays » peuvent être exploitées à un coût bien moindre que les micro-puces à ADN, une plus grande gamme de conditions différentes peut être explorée. Un des principaux avantages des « cell arrays » est la possibilité d’utiliser de courts intervalles de temps pour construire un profil haute-résolution des dynamiques de transcription, ce qui ne peut pas être obtenu par les méthodologies des micro-puces à ADN.
La « cell array » sera complémentée par des souches produisant des facteurs de transcription marqués par étiquette (epitope-tag) dont la production et les expériences de fixation sur l’ADN ainsi que les études d’interactions entre protéines et, dans certains cas, l’étude de localisation de protéines, seront effectuées dans le cadre du Pilier Biologie.